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通常室間隔缺損根據病史、體征、放射線及心電圖檢查，結合心導管和心血管造影進行診斷，但需要和以下幾種疾病進行鑒別： 1、與肺動脈瓣口狹窄進行鑒別，尤其是位于室上嵴和肺動脈瓣之上的室間隔缺損，很容易和肺動脈瓣狹窄混淆，特別是瓣膜型狹窄，后者震顫和雜音的部位較高，肺動脈瓣區第二心音減弱，放射線照片可以顯示肺動脈狹窄后的擴張及肺紋理的減少。 2、與房間隔缺損進行鑒別，原發性房間隔缺損與室間隔缺損不容易鑒別，尤其是伴有肺動脈高壓者，原發性房間隔缺損雜音通常比較柔和，常與右心室肥大、二尖瓣分裂等情況同時出現，心電圖常有PR間期延長，心電向量額面QRS環呈逆鐘向型運行，最大向量左偏，環的主體向上向左，特別具有診斷價值，心導管檢查和超聲心動圖檢查也是鑒別診斷的常用方法，鑒別診斷尤其需要注意左心室缺損。繼發性房間隔缺損收縮期的吹風樣雜音比較柔和，位于胸骨左緣第二肋間，多半沒有震顫，心電圖有不完全右束支阻滯或右心室肥大，而無左心室肥大者額面QRS環多為順鐘向運行，主體是向右、向下。 3、與動脈導管未閉進行鑒別，通常有兩種情況不容易鑒別，一種是高位室間隔缺損合并主動脈瓣脫垂和關閉不全者，容易與典型的動脈導管未閉混淆，前者雜音為雙期，后者表現連續性，前者主動脈結不明顯，后者明顯增大；另一種是動脈導管未閉常伴有肺動脈高壓，僅有收縮期的震顫和雜音，與高位室間隔缺損鑒別較為困難，前者脈壓差較大，雜音位置較高，主動脈結較明顯，可以通過左心室造影和逆行性的主動脈造影進行鑒別。 所以，室間隔缺損作為常見的先天性心臟病，需要與其它幾種先天性心臟病進行鑒別診斷，如肺動脈瓣狹窄、房間隔缺損、動脈導管未閉等。